層析技術的應用與(yu) 發展，對於(yu) 植物各類化學成分的分離鑒定工作起到重大的推動作用。如中藥丹參的化學成分在30年代僅(jin) 從(cong) 中分離到3種脂溶性色素，分別稱為(wei) 丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以後進一步的研究，發現除丹參酮Ⅰ為(wei) 純品外，Ⅱ、Ⅲ、均為(wei) 混合結晶。此後通過各種層析方法，迄今已發現15種單體(ti) （其中有4種為(wei) 我國發現）。新的層析技術不斷發展，隨著層析理論和電子學、光學、計算機等技術的應用，層析技術已日趨完善。

　　一、層析法的基本原理： 層析過程是基於(yu) 樣品組分在互不相溶的兩(liang) “相"溶劑之間的分配係數之差（分配層析），組分對吸附劑吸附能力不同（吸附層析），和寓子交換，分子的大小（排阻層析）而分離。通常又將一般的以流動相為(wei) 氣體(ti) 的稱為(wei) 氣相層析，流動相為(wei) 液體(ti) 的稱為(wei) 液相層析。

　　一、吸附層析法（AdsorptionChromatography）

　　（一）吸附劑、溶劑與(yu) 被分離物性質的關(guan) 係：液一固吸附層析是運用較多的方法，特別適用於(yu) 很多中等分子量的樣品（分子量小於(yu) 1，000的低揮發性樣品）的分離，尤其是脂溶性成分一一般不適用於(yu) 高分子量樣品如蛋白質、多糖或離子型親(qin) 水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果，決(jue) 定於(yu) 吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質三因素。

　　1. 吸附劑：常用的吸附劑有矽膠、氧化鋁、活性炭、矽酸鎂、聚酰胺、矽藻土等。

　　（1） 矽膠：層析用矽膠為(wei) 一多孔性物質，分子中具有矽氧烷的交鏈結構，同時在顆

　　粒表麵又有很多矽醇基。矽膠吸附作用的強弱與(yu) 矽醇基的含量多少有關(guan) 。矽醇基能夠通過氫鍵的形成而吸附水分，因此矽膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過17％，吸附力極弱不能用作為(wei) 吸附劑，但可作為(wei) 分配層析中的支持劑。對矽膠的活化，當矽膠加熱至100～110℃時，矽膠表麵因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當溫度升高至500℃時，矽膠表麵的矽醇基也能脫水縮台轉變為(wei) 矽氧烷鍵，從(cong) 而喪(sang) 失了因氫鍵吸附水分的活往，就不再有吸附劑的性質，雖用水處理亦不能恢複其吸附活性。所以矽膠的活化不宜在較高溫度進行（一般在170cC以上即有少量結合水失去）。

　　矽膠是一種酸性吸附劑，適用於(yu) 中性或酸性成分的層析。同時矽膠又是一種弱酸性陽離子交換劑，其表麵上的矽醇基能釋放弱酸性的氫離子，當遇到較強的堿注化台物，則可因離子交換反應而吸附堿性化合物。

　　（2）氧化鋁：氧化鋁可能帶有堿性（因其中可混有碳酸鈉等成分），對於(yu) 分離一些堿性中草藥成分，如生物堿類的分離頗為(wei) 理想。但是堿性氧化鋁不宜用於(yu) 醛、酮、醋、內(nei) 酯等類型的化合物分離。因為(wei) 有時堿性氧化鋁可與(yu) 上述成分發生次級反應，如異構化、氧化、消除反應等。除去氧化鋁中絢堿性雜質可用水洗至中性，稱為(wei) 中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬於(yu) 堿性吸附劑的範疇，本適用於(yu) 酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁，不僅(jin) 可中和氧化鋁中含有的堿性雜質，並可使氧化鋁顆粒表麵帶有NO3一或CI一的陰離子，從(cong) 而具有離於(yu) 交換劑的性質，適合於(yu) 酸性成分的層析，這種氧化鋁稱為(wei) 酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁，用於(yu) 拄層析的，其粒度要求在100～160目之間。粒度大子100目，分離效果差：小於(yu) 160目，溶濃流速大慢，易使譜帶擴散。樣品與(yu) 氧化鋁的用量比，一般在1：20～50之間層析柱的內(nei) 徑與(yu) 柱長比例在1：10-20之向。

　　在用溶劑衝(chong) 洗柱時，流速不宜過快，洗脫液的流速一般以每半～1小時內(nei) 流出液體(ti) 的毫升數與(yu) 所用吸附劑的重量（克）相等為(wei) 合適。

　　（3）活性炭：是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌，其次用乙醇洗，再以水洗淨，於(yu) 80℃幹燥後即可供層析用。層析用的活性炭，選用顆粒活注炭，若為(wei) 活性炭細粉，則需加入適量矽藻土作為(wei) 助濾劑一並裝柱，以免流速太慢。活性炭主要且於(yu) 分離水溶性成分，如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭的有為(wei) 吸附作用，在水溶液中zui強，在有機溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力zui弱，而有機溶劑則較強。例如以醇-水進行洗脫時，則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。活性炭對芳香族化合物的吸附力大於(yu) 脂肪族化合物，對大分子化合物的吸附力大於(yu) 小分子化合物。利用這些吸附性的差別，可將水溶性芳香族物質與(yu) 脂肪族物質分開，單糖與(yu) 多糖分開，氨基酸與(yu) 多肽分開。

　　2.溶劑：層析過程中溶劑的選擇，對組分分離關(guan) 係極大。在柱層析時所用的溶劑（單一劑或混合溶劑）習(xi) 慣上稱洗脫劑，用於(yu) 薄層或紙層析時常稱展開劑。洗脫劑的選擇，須根據被分離物質與(yu) 所選用的吸附劑性質這兩(liang) 者結合起來加以考慮在用極性吸附劑進行層析時，當被分離物質為(wei) 弱極性物質，一般選用弱極性溶劑為(wei) 洗脫劑；被分離物質為(wei) 強極性成分，則須選用極性溶劑為(wei) 洗脫劑。如果對某一極性物質用吸附性較弱的吸附劑（如以矽藻土或滑石粉代替矽膠），則洗脫劑的極性亦須相應降低。

　　在柱層操作時，被分離樣品在加樣時可采用於(yu) 法，亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解後加入。溶解樣品的溶劑應選擇極性較小的，以便被分離的成分可以被吸附。然後漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個(ge) 十分緩慢的過程，稱為(wei) “梯度洗脫"，使吸附在層析柱上的各個(ge) 成分逐個(ge) 被洗脫。如果極性增大過訣（梯度太大），就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力，有時可以用溶劑的介電常數（ε）來表示。介電常數高，洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅(jin) 適用於(yu) 極性吸附劑，如矽膠、氧化鋁。對非極性吸附劑，如活性炭，則正好與(yu) 上述順序相反，在水或親(qin) 水住溶劑中所形成的吸附作用，較在脂溶性溶劑中為(wei) 強。

　　3.被分離物質的性質：被分離的物質與(yu) 吸附劑，洗脫劑共同構成吸附層析中的三個(ge) 要素，彼此緊密相連。在的吸附劑與(yu) 洗脫劑的條件下，各個(ge) 成分的分離情況，直接與(yu) 被分離物質的結構與(yu) 性質有關(guan) 。對極性吸附劑而言，成分的極性大，吸附住強。

　　當然，中草藥成分的整體(ti) 分子觀是重要的，例如極性基團的數目愈多，被吸附的住能就會(hui) 大些，在同係物中碳原子數目少些，被吸附也會(hui) 強些。總之，隻要兩(liang) 個(ge) 成分在結構上存在差別，就有可能分離，關(guan) 鍵在於(yu) 條件的選擇。要根據被分離物質的性質，吸附劑的吸附強度，與(yu) 溶劑的性質這三者的相互關(guan) 係來考慮。首先要考慮被分離物質的極性。如被分離物質極性很小為(wei) 不含氧的萜烯，或雖含氧但非極性基團，則需選用吸附性較強的吸附劑，並用弱極性溶劑如石油醚或苯進行洗脫。但多數中藥成分的極性較大，則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑（一般Ⅲ～Ⅳ級）。采用的洗脫劑極性應由小到大按某一梯度遞增，或可應用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑係統中的分離情況。此外，能否獲得滿意的分離，還與(yu) 選擇的溶劑梯度有很大關(guan) 係。現以實例說明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與(yu) 樣品極性之間的關(guan) 係。如有多組分的混合物，象植物油脂係由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當以矽膠為(wei) 吸附劑時，使油脂被吸附後選用一係列混合溶劑進行洗脫，油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。

　　又如對於(yu) C-27甾體(ti) 皂甙元類成分，能因其分字中羥基數目的多少而獲得分離：將混合皂甙元溶於(yu) 含有5％氯仿的苯中，加於(yu) 氧化鋁的吸附柱上，采用以下的溶劑進行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的矽酸鎂以替代氧化鋁，由於(yu) 矽酸鎂的吸附性較弱，洗脫劑的極牲需相應降低，亦即采用苯或含5％氯仿的苯，即可將一元羥基皂甙元從(cong) 吸附劑上洗脫下來。這一例子說明，同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時，需用不同的溶劑才能達到相同的分離效果，從(cong) 而說明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guan) 係。

　　（二）簿層層析：薄層層析是一種簡便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平麵如玻璃片上，形成一薄層進行層析時一即稱薄層層析。其原理與(yu) 柱層析基本相似。

　　1.薄層層析的特點：薄層層析在應用與(yu) 操作方麵的特點與(yu) 柱層析的比較。

　　2.吸附劑的選擇：薄層層析用的吸附劑與(yu) 其選擇原則和柱層析相同。主要區別在於(yu) 薄層層析要求吸附劑（支持劑）的粒度更細，一般應小於(yu) 250目，並要求粒度均勻。用於(yu) 薄層層析的吸附劑或預製薄層一般活度不宜過高，以Ⅱ～Ⅲ級為(wei) 宜。而展開距離則隨薄層的粒度粗細而定，薄層粒度越細，展開距離相應縮短，一般不超過10厘米，否則可引起色譜擴散影響分離效果。

　　3.展開劑的選擇：薄層層析，當吸附劑活度為(wei) 一定值時（如Ⅱ或Ⅲ級），對多組分的樣品能否獲得滿意的分離，決(jue) 定於(yu) 展開劑的選擇。中草藥化學成分在脂溶性成分中，大致可按其極性不同而無極性、弱極性、中極性與(yu) 強極性。但在實際工作中，經常需要利用溶劑的極性大小，對展開劑的極性予以調整。 4·特殊薄層：針對某些性質特殊的化合物的分離與(yu) 檢出，有時需采用一些特殊薄層。

　　① 熒光薄層：有些化合物本身無色，在紫外燈下也不顯熒光，又無適當的顯色劑時，則可在吸附劑中加入熒光物質製成熒光薄層進行層析。展層後置於(yu) 紫外光下照射，薄層板本身顯熒光，而樣品斑點處不顯熒光，即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質多為(wei) 無機物。其一是在 254nm紫外光激發下顯出熒光的，如錳激潔的矽酸鋅。另一種為(wei) 在365nm紫外光激發下發出熒光的，如銀激化的硫化鋅硫化鎬。

　　② 絡合薄層：常用的有硝酸銀薄層，用來分離碳原子數相等而其中C一C雙鍵數目不等的一係列化合物，如不飽和醇、酸等。其主要機理是由於(yu) C一C鍵能與(yu) 硝酸銀形成絡合物，而飽和的C一C鍵則不與(yu) 硝酸銀絡合。因此在硝酸銀薄層上，化台物可由於(yu) 飽和程度不同而獲得分離。層析時飽和化合物由於(yu) 吸附zui弱而Rfzui高，含一個(ge) 雙鍵的較含兩(liang) 個(ge) 雙鍵的Rf值高，含一個(ge) 三鍵的較含一個(ge) 雙鍵的Rf值高。此外，在一個(ge) 雙鍵化台物中，順式的與(yu) 硝酸銀絡合較反式的易於(yu) 進行。因此，還可用來分離順反異構體(ti) 。

　　③ 酸堿薄層和PH緩衝(chong) 薄層：為(wei) 了改變吸附劑原來的酸堿性，可在鋪製薄層時采用稀酸或稀堿以代替水調製薄層。例如矽膠帶微酸性，有時對堿性物質如生物堿的分離不好，如不能展層或拖尾，則可在鋪薄層時，用稀堿溶液0.1～0.5NNa0H溶液製成堿性矽膠薄層。例如豬屎豆堿在以矽膠為(wei) 吸附劑時，以氯仿-丙酮一甲醇（8：2：1）為(wei) 展開劑Rf＜0.1，采用堿性矽膠薄層用上述相同展開劑，Rf值增至0.4左右。說明豬屎豆堿為(wei) ——堿性生物堿。 5.應用：薄層層析法在中草藥化學成分的研究中，主要應用於(yu) 化學成分的預試、化學成分的鑒定及探索柱層分離的條件。

　　用薄層層析法進行中草藥化學成分預試，可依據各類成分性質及熟知的條件，有針對性地進行。由於(yu) 在薄層上展層後，可將一些雜質分離，選擇性高，可使預試結果更為(wei) 可靠。

　　以薄層層析法進中草藥化學成分鑒定，要有標準樣品進行共薄層層析。如用數種溶劑展層後，標準品和鑒定品的Rf值、斑點形狀顏色都*相同，則可作初步結論是同一化合物。但一般需進行化學反應或紅外光譜等一種儀(yi) 器分析方法加以核對。

　　用薄層層析法探索柱層分離條件，是實驗室的常規方法。在進行柱層分離時，首先考慮選用何種吸附劑與(yu) 洗脫劑。在洗脫過程中各個(ge) 成分將按何種順序被洗脫，每一洗脫液中是否為(wei) 單一成分或混合體(ti) ，均可由薄層的分離得到判斷與(yu) 檢驗。通過薄層的預分離，還可以了解多組分樣品的組成與(yu) 相對含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件，即可將此條件用於(yu) 幹柱層析。但亦可以將薄層分離條件經適當改變，轉至一般往層所采用洗脫的方式進行製備柱分離。利用薄層的預分離尋找柱層的洗脫條件時，假定在薄層上所測得的Rf值一樣品在柱層中的比移率（R）。這是由於(yu) 在薄層展開時，薄層固定相中所含的溶劑經過不斷的蒸發，而使薄層上各點位置所含的溶劑量是不等的，靠近起始線的含量高於(yu) 薄層的前沿部分。但若嚴(yan) 格控製層析操作條件，則可得到接近真實的Rf值。用薄層進行某一組分的分離，其Rf值範圍，一般情形下為(wei) 0.85＞Rf＞0.05.此外，薄層層析法亦應用於(yu) 中草藥品種、藥材及其製劑真偽(wei) 的檢查、質量控製和資源調查，對控製化學反應的進程，反應副產(chan) 品產(chan) 物的檢查，中間體(ti) 分析，化學藥品及製劑雜質的檢查，臨(lin) 床和生化檢驗以及毒物分析等，都是有效的手段。